METODE ANALISIS VITAMIN

BAB 1

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Vitamin adalah suatu zat senyawa kompleks yang sangat dibutuhkan oleh tubuh kita yang berfungsi untuk mambantu pengaturan atau proses kegiatan tubuh. Tanpa vitamin manusia, hewan dan makhluk hidup lainnya tidak akan dapatmelakukan aktifitas hidup dan kekurangan vitamin dapat menyebabkan memperbesar peluang terkena penyakit pada tubuh kita.

Vitamin memiliki peranan spesifik di dalam tubuh dan dapat pula memberikan manfaat kesehatan. Bila kadar senyawa ini tidak mencukupi, tubuh dapat mengalami suatu penyakit. Tubuh hanya memerlukan vitamin dalam jumlah sedikit, tetapi jika kebutuhan ini diabaikan maka metabolism di dalam tubuh kita akan terganggu karena fungsinya tidak dapat digantikan oleh senyawa lain. Gangguan kesehatan ini dikenal dengan istilah avitaminosis. Di samping itu, asupan vitamin juga tidak boleh berlebihan karena dapat menyebabkan gangguan metabolisme pada tubuh.

Dalam penentuan apakah makanan itu mengandung vitamin apa tidak, diperlukan suatu pengujian agar dapat mengetahui kadar vitamin yang ada seperti vitamin A, B1, B2, B3, B5, B6, B8, B9, B12, C, D, E, dan K. Dengan mengetahui kadar vitamin yang ada dalam bahan pangan, maka kita dapat mengetahui kadar vitamin yang diperlukan oleh tubuh kita agar tidak terjadi kekurangan vitamin yang dapat mengganggu kesehatan tubuh kita. Oleh karena itu dibuatlah makalah ini untuk mengetahui tentang metode analisis vitamin. 

I.2 Rumusan Masalah

Rumusan masalah pada makalah ini adalah sebagai berikut:

1.      Bagaimana metode analisis vitamin?

I.3 Maksud dan Tujuan

Maksud pembuatan makalah adalah untuk mengetahui apa saja vitamin, struktur, dan prosesnya. Sedangkan tujuannya yaitu agar pembaca dapat memperoleh informasi tentang vitamin. Makalah ini digunakan untuk memenuhi tugas analisa pangan agar memperoleh nilai yang baik.

BAB II

 ISI

II.1 Vitamin

Istilah vitamin pertama kali digunakan pada tahun 1912 oleh Cashimir Funk di Polandia. Dalam upaya menemukan zat di dalam dedak beras yang mampu menyembuhkan penyakit beri-beri, ia menyimpulkan bahwa penyakit tersebut disebabkan oleh kekurangan suatu zat di dalam makanan sehari-hari. Zat ini sangat dibutuhkan untuk hidup (vita) dan mengandung unsur nitrogen (amine), oleh sebab itu diberi nama vitamine. Penelitian selanjutnya membuktikan bahwa ada beberapa jenis vitamin yang ternyata tidak merupakan amine. Oleh sebab itu, istilah “vitamine” kemudian diubah menjadi vitamin (Almatsier, 2010).

            Berdasarkan kelarutannya, vitamin dibagi menjadi dua golongan utama, yaitu (Sirajuddin dan Najamuddin, 2011):

1.         vitamin yang larut dalam air, meliputi vitamin B dan C. Menurut Kodicek (1971), vitamin yang larut dalam air disebut prakoenzim (procoenzym).Vitamin-vitamin ini dapat bergerak bebas dalam badan, darah, dan limfa. Karena sifat kelarutannya, vitamin yang larut dalamair mudah rusak dalam pengolahan dan mudah hilang atau terlarut bersama air selama pencucian bahan. Di dalam tubuh, vitamin ini disimpan dalam julah terbatas dan kelebihan vitamin akan dikeluarkan atau diekskresikan melalui urin. Oleh karena itu, untuk mempertahankan saturasi jaringan vitamin ini harus sering di konsumsi.

2.         vitamin yang larut dalam lemak, meliputi vitamin A, D, E, dan K. Golongan vitamin yang larut dalam lemak disebut alosterin. Setelah diserap dalam tubuh, vitamin akan disimpandalam jaringan-jaringan lemak, terutama hati. Karena sifatnya tidak larut dalam air, vitamin-vitamin demikian tidak dieksresikan. Akibatnya, didalam tubuh dapat disimpan dalam jumlah banyak, sehingga kemungkinan terjadinya toksisitas jauh lebih besar daripada vitamin yang larut dalam air.

II.2 Metode Analisis Vitamin

Beberapa metode pengukur vitamin secara langsung dan memberikan pengukuran kuantitatif. Ini direkomendasikan untuk digunakan terutama untuk vitamin yang berguna secara klinis.  Namun ini mahal dan tidak semua laboratorium dapat memberikan tes tersebut. Metode ini meliputi:

• HPLC (metode referensi)

• Immunoassays (ELISA, RIA, FIA)

• Colorimetric dan Spektrofotometri tes

• Fluorometric assay & Chemiluminescence assay

• amperometri assay

Karena vitamin berfungsi sebagai ko-faktor dan substrat dalam berbagai reaksi tubuh, beberapa metode memanfaatkan properti ini dan secara tidak langsung mengukur vitamin dengan mengukur aktivitas enzim di bawah pengaruh. Metode ini relatif lebih murah dan bisa menjadi semi-kuantitatif atau kualitatif. Namun beberapa metode ini digunakan saat ini untuk penelitian saja dan ini termasuk:

• Tes Metabolit pemuatan

• enzim aktivasi eritrosit assay

• Tes kerapuhan Eryhtrocyte

• Waktu Prothrombin

• metode mikrobiologi

• Bioassay (in-vivo & in-vitro)

II.3      Metode  Langsung untuk Penentuan Vitamin

II.3.1   High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam kromatografi, campuran tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada salah satu ujung media porus seperti adsorben, yang disebut alas atau landasan kromatografi. Zona campuran kemudian digerakan dengan larutan suatu cairan atau gas yang bergerak sebagai pembawa, melaui media porus tersebut, yang berupa partikel-partikel yang ”diam“ (tidak bergerak, statisiones). Sehingga akibatnya masing-masing komponen dari campuran tersebut akan terbagi (terdistribusi) secara tidak merata antara alas yang “diam” dan cairan atau gas yang membawanya. Akibat selanjutnya, masing-masing komponen akan bergerak (bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential migration) dan dengan demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut pada waktu yang berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara komponen-komponen yang ada.

Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-komponen sampel diantara dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik kromatografi yang dimana fasa gerak dan fasa diamnya menggunakan zat cair adalah HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau didalam bahasa Indonesia disebut KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).

Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar. Pada prakteknya, metode pembandingan area standar dan sampel kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan suatu konsentrasi standar. Oleh karena itu, dilakukan dengan  menggunakan teknik kurva kalibrasi.

HPLC yang modern telah mucul akibat pertemuan dari kebutuhan, keinginan manusia untuk meminimalis pekerjaan, kemampuan teknologi, dan teori untuk memandu pengembangan pada jalur yang rasional. Jelas sebelum era peralatan yang modern bahwa LC (Liquid Chromatography) memiliki kekuatan pemisahan yang sangat ampuh, bahkan untuk komponen-komponen yang berhubungan sangat erat. LC harus ditingkatkan kecepatannya, diotomasasi, dan harus disesuaikan dengan sampel-sampel yang lebih kecil, waktu elusi yang beberapa jam (Underwood, Day. 2002 : 553).

HPLC berbeda dari kromatografi kolom cairan konvensional dalam hal digunakan bahan pengisi kolom berupa partikel yang sangat kecil berukuran sampai 3-5 μm (1μm = 10^-6 m). Sehingga mengharuskan digunakannya tekanan tinggi sampai 20.000 Kpa ( 200 atmosfir) untuk mengalirkan fasa gerak melalui kolom tersebut.

Ternyata, penggunaan bahan pengisi kolom yang lebih kecil ini bukan saja  telah memperbaiki kecepatan analisis, tapi (dari ini yang lebih penting) ialah telah menghasilkan suatu teknik dengan daya pisah yang tinggi. HPLC mempunyai kelemahan- kelemahan yang diantaranya, peralatannya lebih rumit, tidak murah, dan perlu pengalaman. Untuk beberapa jenis zat, metode ini kurang sensitif. Selain itu sampel disyaratkan harus stabil dalam larutan.  

Berdasarkan kepolaran fasa geraknya, HPLC dibagi menjadi 2 macam yaitu :

a)      Fase Normal HPLC

HPLC jenis ini secara esensial sama dengan kromatografi kolom. Meskipun disebut normal, ini bukan bentuk biasa dari HPLC. Kolom ini diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut nonpolar seperti heksan sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6 mm (dan kemungkinan kurang dari nilai ini) dengan panjang 120 nm-250 nm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. Apabila pasangan fasa diam lebih polar daripada fasa geraknya maka sistem ini disebut HPLC fase normal.

b)      Fase Balik HPLC

Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna rantai panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Dalam kasus ini, akan terdapat interaksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Interaksi yang terjadi tidak sekuat interaksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fasa diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu molekul-molekul polar akan lebih cepat bergerak melalui kolom. Sedangkan molekul-molekul non polar akan bergerak lambat karena interaksi dengan gugus hidrokarbon.

Prinsip kerja instumentasi HPLC

HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah campuran komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap komponen dalam sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe₂SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi), misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang punsak-puncaknya terpisah.

Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Keunggulan menggunakan HPLC dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak pada kemampuannya untuk menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil pada suhu tinggi. HPLC tidak terbatas pada senyawa organik tapi mampu menganalisis senyawa anorganik, mampu menganalisis cuplikan yang mempunyai molekul tinggi (beratnya), mampu menganalisis cuplik yang mempunyai titik didih yang sangat tinggi seperti polimer.

Cara kerja instumentasi HPLC

Prinsip kerja alat HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut yang interaksinya kuat dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen yang campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.

Keuntungan menggunakan metode HPLC

- Langsung

- kuantitatif

- Precise & akurat

- Sensitif dan spesifik

- Otomatis

- Tinggi melalui put

Kerugian dalam menggunakan metode ini adalah

- Membutuhkan pretreatment sampel seperti ekstraksi & filtrasi

- Membutuhkan perhatian untuk memilih fase gerak & sampel laju pemompaan

- Awalnya membutuhkan optimasi. Dalam rangka untuk mendapatkan resolusi tinggi dasar rendah dan kembali ketingkat noise yang rendah harus dipertahankan

- Membutuhkan standar internal, kalibrator dan reagen HPLC kelas

- Mahal untuk membeli dan biaya pemeliharaan yang tinggi

II.3.2 Immunoassays

Ada beberapa jenis immunoassays seperti:

- Enzim Linked Sorbant Immuno Assay yang memanfaatkan antibodi terkait dengan enzim.

- Radio-immunoassay bukannya memanfaatkan radio-isotop dan karena pelepasan radioaktif menyangkut ini sekarang keluar tanggal.

- Immunoassays Fluorescent menggunakan antibodi berlabel dengan fluorophore tetapi tidak memiliki kepekaan dibandingkan dengan dua sebelumnya.

Vitamin B12 dan Vitamin-D-dapat dianalisis dengan immunoassay. Tes ini tergantung pada ketersediaan antibodi monoklonal yang menentukan spesifisitas dan sensitivitasnya. Untuk beberapa sampel immunoassays dianggap mahal tetapi biaya dapat dikurangi jika sampel yang cukup adalah 'batch' dianalisis pada 96 format yang baik. Immunoassays adalah metode kedua yang paling dapat diandalkan untuk pengukuran vitamin setelah HPLC.

II.3.3   Kolorimetri dan Spektrofotometri tes

Kolorimetri merupakan suatu metoda analisa kimia yang didasarkan pada tercapainya kesamaan besaran warna antara larutan sampel dengan larutan standar dengan menggunakan sumber cahaya polikromatis dan detektor mata. Metoda ini didasarkan pada penyerapan cahaya tampak dan energi radiasi lainnya oleh suatu larutan.

Metoda ini dapat diterapkan untuk penentuan komponen zat warna ataupun komponen yang belum bewarna, namun dengan menggunakan reagen pewarna yang sesuai dapat menghasilkan senyawa bewarna yang merupakan fungsi dari kandungan komponennya. Jika telah tercapai kesamaan warna berarti jumlah molekul zat penyerap yang dilewati sinar pada kedua sisi tersebut telah sama dan ini dijadikan dasar perhitungan.

kolorimetri terbagi atas 2 metoda, yaitu :

a.                   Kolorimetri visual, menggunakan mata sebagai detektor.

b.                  Fotometri, menggunakan fotosel sebagai detektornya.

Metoda kolorimetri visual merupakan metoda yang konvensional dan sudah jarang digunakan karena tidak akurat. Hal ini disebabkan karena mata hanya sebagai detektor untuk melihat kesamaan warna, bukan sebagai alat ukur intensitas absorbsi.

Metoda kolorimetri visual adalah sebagai berikut :

a.       Tinggi larutan konstan (Constant Depht Methods), terbagi menjadi dua metoda.

            1.  Tabung Nessler 

Pada metoda ini digunakan beberapa tabung reaksi berbentuk silinder. Masing-masing tabung diisi dengan larutan standar dengan konsentrasi terukur dan bervariasi dengan tinggi larutan yang sama. Tabung ini disusun pada rak tabung bercat hitam yang tidak mengkilat, agar tidak memantulkan sinar yang datang pada tabung. Kemudian larutan sampel dengan tinggi yang sama diletakkan di sela tabung-tabung tersebut dan bandingkan warna larutan standar dan sampel dengan melihat dari atas tabung (vertikal). Jika ada warna larutan standar yang sama dengan sampel, berarti konsentrasi sampel sama dengan larutan standar tersebut. Atau jika warnanya berada diantara 2 warna larutan standar yang berdekatan, berarti konsentrasi sampel berada dalam range dari konsentrasi kedua larutan tersebut.

2.   Bajerum Comparator

Pada alat ini, untuk mencapai kesamaan warna antara larutan sampel dengan larutan standar dilakukan dengan cara menggeser larutan sampel disepanjang skala yang berada di atas bajerum. Bajerum comparator ini merupakan suatu kotak transparan persegi panjang yang dibagi dua menurut diagonal bidangnya. Bagian depan dimana skala tertera, diisi dengan larutan standard an bagian lainnya diisi dengan blanko. Pengamatan dialakukan dari bagian depan (horizontal).

b.  Tinggi larutan berbeda (Variable Depth Methods), terbagi menjadi dua metoda

1.   Tabung Herner 

Tabung Herner berupa sepasang silinder dengan keran untuk mengeluarkan larutan dari dalam silinder yang warna larutannya lebih pekat sehingga tingginya berubah, agar didapatkan warna yang sama pada kedua silinder.

2.   Kolorimeter Dubosq 

Pada alat ini kesamaan warna didapatkan dengan cara mengatur tinggi rendahnya pemberat (plunger), agar tinggi larutan dalam bejana berubah sehingga didapatkan intensitas warna yang sama pada spiltfield.

Syarat-syarat warna pada metoda kolorimetri antara lain :

a. Warna yang terbentuk harus stabil dan merupakan fungsi dari konsentrasi.

b.   Reaksi pewarnaan harus selektif.

c.   Larutan harus transparan.

d.   Reproducibilty (ketepatan ulang yang tinggi).

Reaksi kimia antara chromogen dan vitamin menyebabkan perubahan warna. Perkembangan warna menunjukkan adanya vitamin, analisis kualitatif.  Untuk mengukur metode ini, spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas warna 'end point', di mana intensitas warna sebanding dengan konsentrasi vitamin.  Terutama digunakan untuk penentuan vit-C (asam askorbat).

Keuntungan dalam menggunakan metode calorimeter adalah

- Sebuah uji kuantitatif langsung

- Membutuhkan volume sampel kecil

- Otomatis

- Cepat turn-sekitar waktu

- Bisa diterapkan untuk sampel tunggal atau beberapa pada satu waktu  Kerugian

- Sensitivitas dan spesifisitas rendah maka beberapa zat lainnya dapat mengganggu chromogen atau enzim yang digunakan.

- Tidak bisa digunakan untuk semua jenis vitamin

- Kontrol yang tepat dan kalibrator harus digunakan

II.3.4   Fluorometric assay & Chemiluminescence assay

Vitamin tertentu memiliki kemampuan untuk menghasilkan fluoresensi ketika direaksikan dengan fluorophore a. Fluoresensi ini berbanding lurus dengan konsentrasi vitamin. Dalam tes Chemiluminescence, luminol digunakan untuk bereaksi dengan vitamin bunga. Campuran disuntikkan pada tingkat dikontrol melalui kapiler di mana 'reaksi kinetik' diukur dan diberikan pengukuran kuantitatif.  Keuntungan dan kerugian yang mirip dengan tes kolorimetri dan Spektrofotometri.

II.3.5 Tes amperometri

Beberapa vitamin dapat mengalami oksidasi elektro-kimia. Reaksi ini pada penyebab elektroda perubahan potensial listrik yang berbanding lurus dengan konsentrasi vitamin dalam sampel. Kerugian utama dari metode ini adalah kurangnya spesifisitas dan jarang digunakan, kadang-kadang secara paralel dengan HPLC untuk konfirmasi hasil tertentu.

II.4      Metode tidak langsung untuk penentuan vitamin

II.4.1   Metabolit pemuatan uji

Tes ini telah sangat populer di masa lalu.  Ini adalah sebuah assay tidak langsung yang menentukan aktivitas vitamin digunakan sebagai kofaktor untuk metabolit tertentu. 

Langkah-langkah yang terlibat adalah sebagai berikut :

- Pasien diberikan secara oral besar, diukur dosis metabolit tertentu yang digunakan oleh vitamin menarik untuk konversi.

- Darah atau urin sampel diperoleh dari pasien setelah ~ 6 jam menelan.

- Metabolit yang sama diukur dalam sampel ini:  Peningkatan metabolit di atas kisaran normal menunjukkan kekurangan vitamin

Secara signifikan mengurangi metabolit menunjukkan aktivitas vitamin yang normal Misal : Tryptophan adalah metabolit pemuatan untuk vit B6-dan Histidin adalah untuk folat

Keuntungan menggunakan metode metabolit pemuatan uji adalah

- Metode Murah

- Efek samping Minimum

Kerugian menggunakan metode metabolit pemuatan uji adalah

- Metode tidak langsung

- In-vivo karena itu tidak dapat diandalkan karena gangguan oleh faktor-faktor lain

- Tidak berlaku untuk semua vitamin

- Invasif

II.4.2 Uji aktivasi enzim eritrosit

- Hemolysates seluruh darah atau RBC disiapkan

- Aktivitas enzim di bawah pengaruh langsung dari vitamin bunga diukur. Aktivitas enzim ini dikenal sebagai Activity Koefisien (AC).

- Sejumlah vitamin jenuh tertentu ditambahkan.

- Aktivitas enzim ini diukur kembali dan dibandingkan dengan aktivitas enzim sebelum penambahan.

- Peningkatan AC menunjukkan kekurangan vitamin. Dalam kasus vitamin normal atau bahkan vitamin jenuh, AC tidak akan berubah.

- Misal : Kegiatan transketolase diukur untuk mengevaluasi tingkat tiamin, Glutathione reduktase diukur untuk mengevaluasi riboflavin status dan aspartat transaminase (AST) aktivitas diukur untuk analisis vit B6-

II.4.3 Uji fragilitas eritrosit

Digunakan khusus untuk penilaian tingkat vitamin-E. Vitamin ini bertanggung jawab untuk stabilitas membran RBC.

Langkah-langkah yang terlibat:

- Sampel Pasien dibagi menjadi dua aliquot.

- Sel darah merah dalam satu aliquot dicuci dengan 2% H₂O₂ (membran racun radikal bebas), sedangkan sel darah merah dari 2 aliquot dicuci dengan dist. H₂O.

- Setelah 3 jam inkubasi, hemoglobin diukur di kedua aliquot.

- Jika hemolisis sel darah merah dalam aliquot 1 (dicuci dengan H₂O₂) adalah 20% lebih dari hemolisis dalam 2 aliquot (sel darah merah dicuci dengan dist.H₂O), ini akan menunjukkan kekurangan vitamin-E.

II.4.4   prothrombin Waktu

Metode Ini adalah metode spesifik, namun tidak langsung assay untuk penilaian kegiatan vit-K. Sejak vit-K bertanggung jawab untuk aktivasi faktor pembekuan (II, VII, IX, X, protein C, S & Z) meningkat PT> 2 min menunjukkan defisiensi vit-K.  Hal ini dianggap sebagai tes skrining, namun untuk mengkonfirmasi HPLC atau analisis spektrofotometri dianjurkan.

II.4.5   Metode Mikrobiologi (digunakan penelitian saja)

Beberapa mikro-organisme misalnya Lactobacillus Casel dan Lactobacillus Plantoides tergantung pada vitamin tertentu untuk pertumbuhannya.  Mikroorganisme ini tumbuh dalam kaldu atau kultur agar yang mengandung sampel dengan konsentrasi yang tidak diketahui dari vitamin.  Sebuah kontrol negatif yang tidak memiliki vitamin sama sekali juga digunakan.  Inkubasi selama beberapa hari Kepadatan pertumbuhan diukur dengan turbidimetri  Pembentukan asam laktat juga dapat dikuantifikasi yang berbanding lurus dengan konsentrasi vitamin dalam sampel

II.4.6   Bioassay untuk vitamin

Adalah alat penelitian saja dan jarang digunakan secara klinis untuk analisis vitamin. Untuk mengukur enzim dibawah pengaruh vitamin dan efek kekurangan fenotipik.  Ada dua jenis bio-tes:

1.   In-vivo Bioassays

• Membutuhkan hewan hidup lebih kecil dalam ukuran seperti tikus atau ayam

• sifat fisik hewan seperti berat, perilaku, laju respirasi, denyut nadi, anggota tubuh dan gerakan mata dan pengamatan fisik lainnya dicatat.

• Aktivitas enzim di bawah pengaruh langsung dari vitamin yang akan dianalisis ditentukan dalam sampel darah spektrofotometri (nilai puncak).

• hewan tersebut kemudian kekurangan diet yang mengandung vitamin tertentu untuk jangka waktu tertentu.

• Saat hewan ini mulai mengembangkan penyakit yang terkait dengan kekurangan vitamin, sampel darah yang lain diambil dan aktivitas enzim diukur ulang. Ini adalah nilai dasar. Gejala fisik lainnya yang direkam selama keadaan penyakit.

• Kemudian dosis dihitung dan secara bertahap meningkatkan vitamin diumpankan ke hewan pada titik waktu tertentu.

• Aktivitas enzim yang kembali dan gejala fisik mulai membaik.

• Sampel darah diambil pada interval waktu tertentu dan aktivitas enzim diukur sampai puncak (optimal) aktivitas kembali dan gejala penting hewan ini telah sepenuhnya pulih.

• Uji ini memungkinkan konsentrasi vitamin vs aktivitas enzim kurva standar.

• Kurva standar yang sama sekarang dapat digunakan untuk menganalisis vitamin yang sama dalam berbagai model binatang karena aktivitas enzim dapat diukur dan menggunakan kurva, konsentrasi vitamin yang diharapkan dapat diperoleh. misalnya tikus ketika kekurangan vit-D untuk beberapa waktu, akan mengembangkan rakhitis. Vit-D aktivitas enzim 25-hidroksilase dipengaruhi, yang memanfaatkan vit-D sebagai substrat. Hal ini memicu kaskade kejadian yang menyebabkan cacat tulang pada tikus ini. Namun ketika dosis dihitung tertentu vit-D diumpankan gejala sembuh. Aktivitas enzim diukur pada setiap titik waktu dosis dan kurva standar dirumuskan.

Keuntungan menggunakan metode ini adalah

- Dekat dengan realitas

- Bisa menyebabkan menerobos dalam penelitian

Kerugian

- Metode tidak langsung

- Membutuhkan pemantauan yang cermat

- Sulit untuk mempertahankan data yang konsisten karena gangguan oleh faktor-faktor lain

- Tidak berlaku untuk semua vitamin

- Mahal karena manajemen hewan

- Memakan Waktu

- Tidak memiliki aplikasi klinis

2. In-vitro Bioassays

• Tes ini melibatkan menargetkan jalur sel tertentu atau jaringan dalam media kultur.

• Mempengaruhi vitamin dipelajari pada pertumbuhan, proliferasi dan diferensiasi sel.

• Faktor-faktor lain atau bahan kimia seperti: protein, imunoglobulin, kalsium, fosfor yang diproduksi oleh sel-sel & jaringan setelah terpapar vitamin juga diukur.  Misalnya efek anti-oksidatif vit-C dan E yang didirikan oleh tes ini

Keuntungan dalam menggunakan metode ini adalah

- Lebih mudah dari in-vivo

- Lebih baik monitoring & control kondisi

- Kurang memakan waktu & murah

- Dapat digunakan untuk menganalisis efek dari beberapa vitamin

Kerugian dalam menggunakan metode ini adalah

- Tidak Langsung

- Tidak dekat dengan realitas

- Jaringan dan sel kultur beresiko kontaminasi

Daftar Pustaka

Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Day, R.A dan Underwood, A.L., 1986, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.

Khopkar, S.M., 2003, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.

Prawirokusumo, Soeharto, Prof. Dr. M.Sc., 1991, Biokimia Nutrisi dan Vitamin, BPFE, Yogyakarta.

Underwood, A.L. dan R.A. Day. 1999. Analisa kimia kuantitatif. Edisi ke-5. Erlangga :Jakarta. Hal 490 – 542.

Vogel. 1994.  Kimia analisis kuantitatif anorganik. Edisi ke-4. Penerbit EGC :Jakarta. Hal. 243 – 253.